• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:
    Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, nichtimmunogenen, antiviral und immunregulatorisch wirksamen, homogenen a-Interferons, das Protein selbst sowie dessen Verwendung.
    公开号:SU1591814A3
    申请号:SU864027351
    申请日:1986-04-25
    公开日:1990-09-07
    发明作者:Gerkhard Bodo；Ingrid Maurer-Fogi；Edgar Falkner；Silviya Yutta Lindner
    申请人:Boehringer Ingelheim Int；
    IPC主号:
    专利说明:

    1591814
    Лии, т.е. комбинации из ПЕЛЕ-целлюлоз ной колонки и подсоединенной к ней иммуноаффинной колонки с высокоспецифичным, моноклональным антителом. Ионообменная колонка служит для уда- $ ления труднорастворимых составных частей пробы от антител колонны.
    Для колонки с антителами моноклональный, очищенный, полученный из асцитной жидкости мыши анти-интерферон1дС наносят на. ВгСП-активизованную сефарозу 4В (фирма Фармация) в качестве носителя.
    Испытание на интерферон, определение протеина и НРЬС анализ на обращенной фазе показывают, что в результате этой очистки получают 60-90% чистого интерферона-ο/. Наряду с олигомерной формой собранный интерферон содержит 2θ восстановленные формы со свободными 8Н-группами, димеры, тримеры, тетрамеры и кенативные мономеры. Эти компоненты могут быть охарактеризованы биологически и иммунологически как 25 интерферон. Часть этих компонентов можно удалить путем осаждения при рН 4,5 (аммиаком). При этом, в частности, восстанавливаются имеющиеся компоненты. с восстановленными дисульфидными' мостиками, т.е. формы со свободными δΝ-группами (компоненты 5 и 6),.Анализ этого осадка показывает, что, монбмерный интерферон удаляется лишь в незначительном количестве. ,
    Для окончательной очистки примени- 3$ ют ГРЬС-аппаратуру фирмы Фармация с ΜΟΝΟ-3-колонкой типа НК10/10 (катионообменник), в которую вносят до 60 мг белка. Этот колоночный материал ·, представляет собой ионообменник высо- 1 кой проницаемости, с отличным разделительным действием и большим преимуществом, заключающимся в том, что, несмотря на относйтельно большие количества восстанавливаемого протеина,
    .окончательная очистка длится лишь несколько часов, при этом используют стерилизованные буферные растворы и процесс ведут при комнатной темпера- _ туре. '
    •Полученное после осаждения прозрачнре образование наносят на колонку. Особое значение при разделении ГРЬС имеет применяемый буфер. Он должен элюировать компоненты интерферона и после этого легко удаляться. Этими свойствами обладает применяемый аммоний-ацетатный буфер, который элюирует интерферон по градиентной программе., Интерферон элюируют в виде острого пика со слабо выраженными плечами. Как "плечевую" фракцию, так и более поздно элюированные компоненты отделяют от основного пика чистого интерферона. Пик чистого интерферона собирают и из'него берут аликвотные части для НРЬС-анализа, 303-гель электрофореза, определения протеина, испытания на интерферон и определе-’ ния эндотоксина.
    С помощью хроматографии разделяют практически все компоненты *от главного пика и получают гомогенный интерферон, который при гель-проникающей НРЬС показывает содержание мономера свыше 99%. Обращенная фаза НРЬС показывает лишь около 1% ненативного мономера, хроматофокусировка - 2,5% ненативного мономера. ·
    ΜΟΝΟ-5-колонку перед повторным применением промывают 0,5 М ПаС1+0,1 М Να-фосфата, рН=.8,0, для удаления адсорбированных примесей. Сохраняют ее в 25%-ном этаноле.
    Летучий буфер можно полностью удалить' путём лиофилизации. Для это|го собранный интерферон порциями по 2 мп помещают в автоклави-_ рованные лио-ампулы (объемом 8 мл), соответственно в ампулу помещают 1 8 мг чистого интерферона. Ампулы после этого закрывают предварительно промытыми и выдерживающими давление лиопробками и охлаждают до -20°С. Лиофилизацию осуществляют при -10°С и вакууме· менее -1 мм рт.ст. После удаления буферного раствора температуру повышают до 25°С и лиофилизируют 1 ч. Вакуум сбрасывают и пробки сразу крепко прижимаются. Снабженные алю-зажима— ми ампулы хранят непосредственно после этого в хрлодидьнике или при -20°С.
    В результате осуществления ферментации (относительно кратковременной) вместе с известным способом впервые стало возможно получать интерферон, который по содержанию цнтерферона более 98%, а также в отношении гомогенности, считая на различные компоненты интерферона, более чем на 95% состоит из нативного мономерного интерферона-о(.
    Эта высокая степень чистоты и гомогенности позволяет получить интерферон, свободный оу солей и составных
    частей буферного раствора, в твердой
    6
    5 15918
    форме. Поэтому появилась возможность хранить ^-интерферон более месяца без стабилизаторов, что для хранения, отправки и для воздействия как лекарства имеет особое значение по сравнению с всегда стабилизированными альбумином интерферонами. Даже после 11 мес хранения при 4°С состав интерферона не ухудшается.
    Π р и м е р 1 (исходное Е.соХх; интерферон-с/ Арг; 28°С).
    251 г кислотно-осажденной биомассы, которую хранят при 20°С, вносят в 2500 мл 1%-ной уксусной кислоты, перемешивают в течение 0,5 ч на ледяной бане и дважды в течение 1 мин гомогенизируют с помощью ультразвука типа 45/6. Полиэтиленимин добавляют до конечной концентрации 0,25%, устанавливают значение рН 10 добавлением 5 н. ИаОН и перемешивают 2 ч на ледяной бане, непосредственно после этого значения рН добавлением 5н.
    НС1 устанавливают 7,50.
    Центрифугируют в течение 1 ч в центрифуге СНггзС 66С. При 4°С и 3000 об/мин получают прозрачный сырой экстракт в количестве 2540 мл с содержанием интерферона 17,1x10Ι.Ε. и с содержанием протеина 5830 мг, из чего рассчитывают удельную активность, равную 3,21x10^ Ι.Ε./мг протеина. Сульфат аммония добавляют до 65%-ного насыщения (430 г/л экстракта) . Исходное хранят в течение ночи . при 4-8°С, и образовавшийся осадок в течение 1 ч центрифугируют ца центрифуге Ϊ2-21 ΗίβΤίδρεβά, ротор ΙΑ при 4°С, 1000*0 об/мин. Прозрачный раствор (3120 мл) содержит 0,7% полученного в сыром экстракте интерферона (120х хЮ* Ι.Ε.) .
    Осадок вносят в 0,01 М ЫаСХ и перемешивают при 4-8°С в течение 2 ч, устанавливают значение рН 7,50 добавлением 5н. ЫаОН и центрифугируют до получения прозрачного раствора. Прозрачный раствор диализируют с помощью патрона диализа (ЫерЬгозз АХХецго, фирма Органон техника) по отношению 0,01 М ЫаСХ до 390 м осмол/л. Содержание интерферона составляет 13,Зх х10э Ι.Ε. '(=77,6%)..
    Диализат непосредственно после этого хроматографируют (тандемная хроматография) . Для предварительной колонки применяют 125 г ПЕ 52 целлюлозного порошка фирмы Ватман в тркс-ЫаСХбуфере, рН 7,5, 0,025 моль трис-НС1+ +0,2 моль ЫаСХ, что соответствчет 0,5 г колоночного материала/г биомассы. Для аффинной колонки применяют соединенный с Вг-СЫ-активированной сефарозой 4В (фирма Фармация) моноклональный анти-интерферон-1дС (ΕΒΙ I).
    Ιθ Готовый коленчатый материал хранят в фосфатно-буферном растворе поваренной соли (РВ8) с азидом натрия при
    4-8рС. Перед применением колонку с антителами промывают раствором 0,1 И ^5 лимонной кислоты в 25%-ном этилгликоле и непосредственно после этого отмывают до нейтральной реакции РВ8. На грамм биомассы в случае колонки с антителами необходим объем колонки 0,220 1,0 мл. Диализированный раствор интерферона сначала прокачивают через обе колонки (предварительную колонку и колонку с антителами) и элюат контролируют измерением экстинкции при 280 нм. После нанесения раствора интерферона промывают трис-ЫаСХ-буфером, рН 7,5 до тех пор, пока количество протеина в элюате не снизится до 1/20 начального количества. Непосредственно после этого колонку с антителами отсоединяют от предварительной колонки и одну промывают трисЫаСХ-буфером, рН 7,5.
    Элюирование интерферона, присоединенного к антителам, осуществляют ·
    0,1 М лимонной кислотой в 25%-ном этиленгликоле, причем экстракцию алюа* та осуществляют снова при 280 нм. Пик протеина, содержащий интерферон, собирают. Получают 16,8 мл элюата с содержанием интерферона 12,3x10^ Ι.Ε. (-71,9%). .Общее количество протеина составляет 54,4 кг, из чего рассчитывают удельную "активность, равную 22,6x104 Ι.Ε./мг протеина.
    Для дальнейшей очистки элюат добавлением аммиака доводят до значения рН 4,5 и образовавшийся осадок отделяют. Прозрачный раствор (18,3 мл) содержит 46,3 мг протеина и 11,8х х10^ Ι.Ε. интерферона, считая на сырой протеин. Это соответствует выходу 69% (255x104 Ι.Ε./мг протеина).
    Для окончательной очистки применяют РРЬС-аппаратуру фирмы Фармация с ΜΟΝΟ-8-колонкой, типц НК 10/10 (катионообменник).
    Полученный после осаждения прозрачный раствор вносят в колонку, ко7
    8
    15918'
    торую предварительно промывают 0,1 М буфером - ацетатом аммония, рН 4,5-5,0, и промывают до тех пор, пока экстинкция при 280 мм не возвратится к исход->ному значению. Элюирование адсорбированного интерферона осуществляют с малым солевым градиентом в результате примешивания 0,5 М буфера - ацетата аммония, рН 4,5-5,0. Интерферон зд .элюируют в виде острого пика. "Плечевую” фракцию (К-3) и позднее элюированные компоненты (К5-К7) отделяют от главного пика чистого интерферона.
    Пик чистого интерферона собирают и иэ него отбирают аликвоты для НРЬС-анализа, 8Ь5-гель-электрофореза, определения протеина, теста на Интерферон . и определения эндотоКсичностч. В"плечевой" фракции (9,1 мп) обнаруживаю·!· 20 всего 4,1 щг протеина, содержание интерферона составляет 1,33x109 Ι.Ε. (7,7%). Отсюда получают 324x10* Ϊ.Έ./
    /мг протеина. Основной сбор 9,8 мл · содержит 5;18х10^ Ι..Ε. (30>3%) чистого интерферона и всего 16,1 мг протеина, отсюда удельная активность^ составляет 322x10^ Ι.Ε./мг протеина.
    </-Интерферон порциями максимально по 2 мл помещают в автоклавные лиоампулы (объем 8 мл), что соответствует количеству интерферона в ампуле • 1 - 8 мг чистого интерферона. Ампулы затем закрывают предварительно промытыми и автоклавированными лио-пробками и охлаждают до -20°С. Лиофилизацию осуществляют при -10°С и вакууме менее 1 мм рт.ст. После удаления буферного’ раствора температуру увеличивают до 25еС и продолжают лиофилизировать 1ч. Вакуум сбрасывают и пробки сразу плотно закрывают. Снабженные алю-зажимами ампулы непосредственно после этого хранят в холодильнике или .при -20&0.
    Пр им е р 2. Соединение ΕΒΙ 1-антитела с СИВТ-активированной сефарозой 4 В.
    ΕΒΙ-Ι антитела сначала растворяют в 0,5 М ЫаС1/0,2 М ПаНСОь, рН 8,4 (как можно меньше буферного раствора) и по отношению к буферу диализируют раствор до тех пор, пока во внешнем растворе с хлоридом бария нельзя обнаружить сульфат-ионы, Необходимо сразу же полностью удалить сульфат аммония, так как аммоний-ионы мешают дальнейшему присоединению к носителю. Концентрацию протеина устанавливают после этого 5 мг/мл добавлением буферного раствора. Для нанесения используют в качестве· носителя СИВг-активированную сефарозу 4 В (Фармация). Ее предварительно промывают.. На каждые 25 мг ΕΒΙ-Ι-антитела применяют 1 г активированной сефарозы. Соединение осуществляют в указанном буфере (рН 8,4) при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого ΕΒΙ-1-сЪфарозу по предписанию отсасывают на фильтре и промывают. В фильтрате не остается более 5% используемого.ΕΒΙ-1-антитела. Готовая ΕΒΙ-Ι-сефароза хранится в РВ5-абзиде в холодильнике.
    The invention relates to biotechnology and medicine and relates to the production of recombinant "/ -interferon. The purpose of the invention is to simplify the process. The way is that spend. Homogenization of an 8-9 hour culture. The invention relates to biotechnology and medicine, concerns the production of high-purity, non-immunogenic recombinant interferon and can be used in medicine and veterinary medicine.
    The aim of the invention is to simplify the process.
    The study of various enzyme formations shows that the composition of mixtures containing interferon varies depending on the fermentation conditions. In particular, the amount
    2
    E.sY biomass containing coding "to interferon rEKZZ plasmid DNA, centrifugation at 4 ° C and 3000 rev / min for 1 hour, added to the extract to ammonium sulfate saturation 65% solution, followed by separating the resulting" sludge added sodium chloride is added to the supernatant and the pH is adjusted to 7.5, followed by centrifugation under the indicated conditions and dialysis. Carry out two-fold chromatography in paired columns on cellulose in the first column and the monoclonal antibody EB 1-1 bound to the carrier in the second column with elution of interferon bound citric acid in ethylene glycol, bring the eluate to pH 4.5 ,. carry out chromatography on the cation exchanger of the supernatant, followed by elution with a weak salt gradient with the addition of 0.5 M ammonium acetate, emit "/ -interferon by lyophilization of the eluate.
    (with
    cl
    ς © ·
    00
    Iai *.
    component 1-methionine-interferon-a /, almost separating component, changes with the duration of fermentation: methionine — interferon — ύί is formed only after 8-9 hours of fermentation.
    Thus, as a result of a break in the fermentation process, interferon preparations which do not contain methionine interferon are obtained after a certain time.
    A feature of the method is the use of "tandem" chromatography
    1591814
    Leah, i.e. combinations of a PELE cellulose column and an immunoaffinity column with a highly specific, monoclonal antibody connected to it. The ion exchange column serves to remove the hardly soluble constituents of the sample from the column antibodies.
    For a column with antibodies, monoclonal, purified, anti-interferon1dS, obtained from mouse ascites fluid, is applied on. VgSP-activated Sepharose 4B (company Pharmacy) as a carrier.
    The test for interferon, the determination of protein and HPAS analysis on the reversed phase show that as a result of this purification receive 60-90% pure interferon-ο /. Along with the oligomeric form, the collected interferon contains 2θ reduced forms with free 8H-groups, dimers, trimers, tetramers, and kenative monomers. These components can be characterized biologically and immunologically as interferon 2 5. Some of these components can be removed by precipitation at pH 4.5 (ammonia). In this case, in particular, the existing components are restored. with reduced disulfide bridges, i.e. forms with free δΝ-groups (components 5 and 6),. Analysis of this precipitate shows that monbmeric interferon is removed only in insignificant amounts. ,
    For final purification, apply the FHC equipment of the company Pharmacy with a ΜΟΝΟ-3-column type NK10 / 10 (cation exchanger), in which up to 60 mg of protein is introduced. This columnar material · represents exchanger 1 Coy high permeability with excellent separation effect and a great advantage is that, despite the large quantities of recovered otnosytelno protein
    The final cleaning lasts only a few hours, while using sterilized buffer solutions and the process is carried out at room temperature. '
    • The formation obtained after precipitation is applied to the column. The buffer used is of particular importance when dividing the GRS. It must elute the components of interferon and then be easily removed. These properties have used ammonium acetate buffer, which elutes interferon according to the gradient program. Interferon is eluted in the form of a sharp peak with poorly pronounced shoulders. Both the "humeral" fraction and the later eluted components are separated from the main peak of pure interferon. The peak of pure interferon is collected and aliquot parts are taken for HPHS analysis, 303 gel electrophoresis, protein determination, interferon testing, and endotoxin determination.
    Using chromatography, virtually all components * are separated from the main peak and a homogeneous interferon is obtained, which, with gel permeation HPAc, shows a monomer content in excess of 99%. The reversed HPCB phase shows only about 1% of the non-native monomer, chromatofocusing - 2.5% of the non-native monomer. ·
    Повтор-5-column before re-use is washed with 0.5 M PaCl + 0.1 M α-phosphate, pH = .8.0, to remove adsorbed impurities. Keep it in 25% ethanol.
    Volatile buffer can be completely removed by lyophilization. For this purpose, the collected interferon in portions of 2 mp is placed in autoclavated lyo-ampoules (8 ml volume), respectively, 1 8 mg of pure interferon is placed in the ampoule. The vials are then closed with pre-washed and pressure-resistant lyoprobes and cooled to -20 ° C. Lyophilization is carried out at -10 ° C and vacuum · less than -1 mm Hg After removing the buffer solution, the temperature is raised to 25 ° C and 1 hour is lyophilized. The vacuum is discarded and the plugs are pressed firmly at once. The ampoules stocked with alu-clamps are stored immediately thereafter in hrlodidnik or at -20 ° C.
    As a result of fermentation (relatively short-term) together with a known method, it became possible for the first time to obtain interferon, which is more than 98% interferon content, as well as homogeneity, considering the various components of interferon, more than 95% consists of native monomeric interferon-o (.
    This high degree of purity and homogeneity makes it possible to obtain interferon, free oy salts and compound
    parts of the buffer solution in solid
    6
    5 15918
    form. Therefore, it became possible to store the ^ -interferon for more than a month without stabilizers, which is of particular importance for storage, shipment and exposure as medications as compared to the interferons always stabilized by albumin. Even after 11 months of storage at 4 ° C, the composition of interferon does not deteriorate.
    И p and me R 1 (source E.coHx; interferon-c / Arg; 28 ° C).
    251 g of acidic precipitated biomass, which is stored at 20 ° C, is introduced into 2500 ml of 1% acetic acid, stirred for 0.5 h in an ice bath, and homogenized twice for 1 min using 45/6 ultrasound. Polyethylenimine added to a final concentration of 0.25%, set the pH to 10 by adding 5 n. Ion and stirred for 2 h in an ice bath, immediately after this pH by adding 5N.
    HC1 set 7.50.
    Centrifuged for 1 h in a centrifuge SNGGS 66C. At 4 ° C and 3000 rpm, a clear raw extract is obtained in an amount of 2540 ml with an interferon content of 17.1 x 10Ι.Ε. and with a protein content of 5830 mg, from which a specific activity of 3.21 × 10 ^ .Ι./mg of protein is calculated. Ammonium sulfate added to 65% saturation (430 g / l of extract). The original is stored overnight. at 4–8 ° C, and the precipitate formed is centrifuged for 1 h with a centrifuge of Ϊ2-21 ΗίβΤίδρεβά, rotor at 4 ° C, 1000 * 0 rpm. The clear solution (3120 ml) contains 0.7% of interferon obtained in the crude extract (120x xy * .Ε.).
    The precipitate is introduced into 0.01 M NaCX and stirred at 4-8 ° C for 2 hours, the pH is adjusted to 7.50 by the addition of 5N. NaOH and centrifuged to obtain a clear solution. The clear solution was dialyzed using a dialysis cartridge (Hyperhex AHHetzgo, Organon Technique) with a ratio of 0.01 M NaAC to 390 m osmol / l. The content of interferon is 13, 3x x10 e Ι.Ε. '(= 77.6%) ..
    Dialysate immediately after this chromatographic (tandem chromatography). For the pre-column, 125 g of PE 52 of Watman cellulose powder in a trks-NaCCH buffer, pH 7.5, 0.025 mol of Tris-HC1 + +0.2 mol NaAСH are used, which corresponds to 0.5 g of column material / g of biomass. For the affinity column, monoclonal anti-interferon-1dC (ΕΒΙ I) coupled with Br-CH-activated Sepharose 4B (Pharmacia firm) is used.
    Ιθ Prepared stock material is stored in phosphate-buffered saline (PB8) solution with sodium azide at
    4-8 p C. Before using, the column with antibodies is washed with a solution of 0.1 And ^ 5 of citric acid in 25% ethyl glycol and immediately after that washed to a neutral reaction of PB8. In a gram of biomass in the case of a column with antibodies, a column volume of 0.220 1.0 ml is required. The dialyzed interferon solution is first pumped through both columns (a pre-column and an antibody column) and the eluate is monitored by measuring the extinction at 280 nm. After applying the interferon solution, it is washed with Tris-NaCX buffer, pH 7.5, until the amount of protein in the eluate drops to 1/20 of the initial amount. Immediately after this, the antibody column is disconnected from the preliminary column and one is washed with Tris-CX buffer, pH 7.5.
    Elution of interferon attached to the antibodies is carried out ·
    0.1 M citric acid in 25% ethylene glycol, and the extraction of aluminum is carried out again at 280 nm. Peak protein containing interferon is collected. Get 16.8 ml of the eluate with an interferon content of 12.3x10 ^ Ι.. (-71.9%). . The total amount of protein is 54.4 kg, from which a specific "activity equal to 22.6x10 4 .Ε. / mg protein is calculated.
    For further purification, the eluate is adjusted to pH 4.5 by addition of ammonia and the precipitate formed is separated. The clear solution (18.3 ml) contains 46.3 mg of protein and 11.8x x10 ^ Ι.Ε. interferon, counting on raw protein. This corresponds to a yield of 69% (255x10 4 .Ε. / mg protein).
    For final purification, Pharmaceutical RRB-equipment with a ΜΟΝΟ-8-column, tip NC NK 10/10 (cation-exchanger) is used.
    The clear solution obtained after precipitation is introduced into the column, which is
    eight
    15918 '
    The tube was pre-washed with 0.1 M buffer — ammonium acetate, pH 4.5–5.0, and washed until the extinction at 280 mm returned to its original value. Elution of the adsorbed interferon is carried out with a small salt gradient as a result of mixing 0.5 M ammonium acetate buffer, pH 4.5-5.0. Interferon zd. Elutiruyut in the form of a sharp peak. The “shoulder” fraction (K-3) and later the eluted components (K5-K7) are separated from the main peak of pure interferon.
    The peak of pure interferon is harvested and aliquots are taken for HPCA analysis, 8L5 gel electrophoresis, protein determination, and interferon test. and determine endotoxical. In the humeral fraction (9.1 mp), I detect ·! · 20 with a total of 4.1 uh of protein, the interferon content is 1.33x109 .Ε. (7.7%). From here they get 324x10 * Ϊ.Έ. /
    / mg protein. The main collection of 9.8 ml · contains 5; 18x10 ^ Ι..Ε. (30> 3%) of pure interferon and only 16.1 mg of protein, hence the specific activity ^ is 322x10 ^ .Ε. / mg of protein.
    </ - Interferon in portions with a maximum of 2 ml is placed in autoclave lyo-ampoules (volume 8 ml), which corresponds to the amount of interferon in the ampoule • 1-8 mg of pure interferon. The vials are then closed with pre-washed and autoclaved lyo plugs and cooled to -20 ° C. Lyophilization is carried out at -10 ° C and vacuum less than 1 mm Hg. After removal of the buffer "the solution temperature increased to 25 C. and continue e lyophilized 1h. The vacuum is dropped and the plugs are immediately tightly closed. Ampoules supplied with alu-clamps immediately afterwards are stored in a refrigerator or at -20 & 0.
    Pr im e 2. Compound ΕΒΙ 1-antibodies with SIVT-activated separate Century 4 B.
    ΕΒΙ-Ι antibody is first dissolved in 0.5M YaS1 / v 0.2M Panza, pH 8.4 (as little as possible of buffer solution) and dialyzed against the buffer solution as long as the external solution with barium chloride can not to detect sulfate ions. It is necessary to completely remove ammonium sulfate immediately, since ammonium ions interfere with further adherence to the carrier. The protein concentration is then set to 5 mg / ml by adding a buffer solution. For application, CIVg-activated Sepharose 4 V is used as a carrier (Pharmacy). It is pre-washed .. For every 25 mg of ΕΒΙ-антитела-antibody, 1 g of activated sepharose is used. The compounding is carried out in the indicated buffer (pH 8.4) at room temperature for 2 hours. After this, the prescription of α-1-pharose is aspirated on the filter and washed. No more than 5% of the used α-1 antibodies remain in the filtrate. The finished ΕΒΙ-Ι-sepharose is stored in PB5-abzida in the refrigerator.
    权利要求:
    Claims (1)
    [1]
    Claim
    A method for producing recombinant οί-interferon, which involves suspending the initial E.massoc biomass in a buffer solution, carrying out the process of disintegrating it under optimal 25 conditions, separating the target fraction of the supernatant in a centrifugal field at 4 & C, adding ammonium sulfate to it to 65% saturation with subsequent separation and resolving of the precipitate, 30 dialysis and double chromatographic purification on ion-exchange cellulose, and then on an immunosorbent containing immobilized antibodies, and cation exchanger with elution with Amount of ammonium acetate and the selection of the target product, characterized in that, in order to simplify the process, the E. coli biomass is an 8-9 hour culture of the 4θ HB 101 strain, containing the pEK 33 DNA plasmid, this disintegration of the biomass is carried out at a pH of 7.5 to 10.0 in the presence of 0,10,25% polyethylene amine 600-600,
    45 the sedimentation of the precipitate is carried out in a 0.0ί M solution of chloride. mouse to οί-interferon mol.m.
    55_: 150000 Yes, with the elution of the associated
    c / interferon antibodies carry out
    ^ 1 citric acid solution
    > 25% ethylene glycol solution, in-,
    the eluate is adjusted to pH 4.5 with a solution
    9,159Ϊ81Α u
    ammonia, the resulting osacidrophilic sulfate-containing polydates are separated, and the sorbent, on the basis of a monodisperse product, is lyophilized as the cation exchanger used, followed by separation.
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    US4228154A|1980-10-14|Purification of plasma albumin by ion exchange chromatography
    US6835379B2|2004-12-28|Method of producing IgG
    JP2644946B2|1997-08-25|Purification method of IgG-monoclonal antibody and method of using the same
    US4359389A|1982-11-16|Method for the purification of interferon
    CA2816050C|2020-06-23|Method for purifying human granulocyte-colony stimulating factor from recombinant e. coli
    SU1591814A3|1990-09-07|Method of producing recombinant alpha-interferon
    IL237311A|2019-07-31|Correctly folded etanercept in high purity and excellent yield
    RU2614119C9|2017-08-15|Method of producing human immunoglobulin
    Fried et al.1971|[22] Water-soluble nonionic polymers in protein purification
    Capela et al.2019|Sustainable strategies based on glycine–betaine analogue ionic liquids for the recovery of monoclonal antibodies from cell culture supernatants
    US4476109A|1984-10-09|Method of preparing gamma globulin suitable for intravenous administration
    EP0035026A1|1981-09-09|A process for preparing an injectable insulin preparation
    US9902753B2|2018-02-27|Method of purifying a long-acting human growth hormone
    RU2054044C1|1996-02-10|Method of preparing human recombinant gamma-interferon without n-terminal methionine
    JP3360315B2|2002-12-24|Advanced purification method of human serum albumin
    US4909941A|1990-03-20|High performance liquid chromatography mobile phase
    EP0117470B1|1987-09-09|Process for producing interferon | subtypes 26k and 21k
    EA035448B1|2020-06-17|PROCESS FOR PURIFICATION OF rHu-GCSF
    JP2016501898A|2016-01-21|Protein purification
    WO1980000398A1|1980-03-20|Serum growth materials
    CN110563833A|2019-12-13|Preparation method of human serum albumin standard substance raw material, product and application thereof
    BR112019012273A2|2019-12-03|Process for Purification of Lipopolipeptide Antibiotics from Culture Broths and Uses of a Cation Exchange Resin
    PT85956B|1990-07-31|PROCESS FOR PROTEIN PURIFICATION
    US3586607A|1971-06-22|Process for the recovery and purification of lysozyme
    SU698623A1|1979-11-25|Method of producing trypsin inhibitor
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    PT82452A|1986-05-01|
    CA1340281C|1998-12-22|
    DE3689008D1|1993-10-21|
    FI861748A0|1986-04-25|
    NO166727C|1991-08-28|
    JP2566919B2|1996-12-25|
    GR861093B|1986-08-26|
    AT94588T|1993-10-15|
    KR940010024B1|1994-10-20|
    PT82452B|1988-11-30|
    IE861095L|1986-10-27|
    DE3515336C2|1994-01-20|
    AU598460B2|1990-06-28|
    NZ215969A|1990-08-28|
    ZA863108B|1987-12-30|
    KR860008270A|1986-11-14|
    IE61444B1|1994-11-02|
    EP0203382A3|1988-04-27|
    PH30912A|1997-12-23|
    NO861635L|1986-10-28|
    EP0203382B1|1993-09-15|
    DK186486D0|1986-04-23|
    FI861748A|1986-10-28|
    NO166727B|1991-05-21|
    HU202883B|1991-04-29|
    ES554372A0|1987-08-01|
    IL78604A|1991-11-21|
    IL78604D0|1986-08-31|
    ES8707554A1|1987-08-01|
    DE3515336A1|1987-01-22|
    AU5677586A|1986-10-30|
    EP0203382A2|1986-12-03|
    JPS61282098A|1986-12-12|
    HUT41073A|1987-03-30|
    DK186486A|1986-10-28|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    ZA796175B|1978-11-24|1980-11-26|Hoffmann La Roche|Purified proteins and process therefor|
    FI77877C|1979-04-20|1989-05-10|Technobiotic Ltd|Process for the preparation and purification of human Le-shaped interferon protein.|
    CH651308A5|1980-07-01|1985-09-13|Hoffmann La Roche|INTERFERON AND THEIR PRODUCTION.|
    ZA814375B|1980-07-01|1982-07-28|Hoffmann La Roche|Interferons and process for their preparation|
    US4364863A|1980-12-29|1982-12-21|Schering Corporation|Extraction of interferon from bacteria|
    DE3220116C2|1982-05-28|1993-02-18|Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach, De|
    US4534906A|1982-11-01|1985-08-13|Genentech, Inc.|Removal of impurities from human leukocyte interferon preparations|
    DE3382547D1|1983-01-12|1992-05-27|Chiron Corp|SECRETORIC EXPRESSION IN EUKARYOTS.|
    DE3306060A1|1983-02-22|1984-08-23|Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim|NEW IMMUNGLOBULIN-PRODUCING HYBRID CELL LINES, THEIR USE AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF|US4748234A|1985-06-26|1988-05-31|Cetus Corporation|Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts|
    DE3813124A1|1988-04-15|1989-10-26|Krieg Benno|Distillable buffer solutions and their uses|
    EP1104809A1|1994-04-09|2001-06-06|F. Hoffmann-La Roche Ag|Process for producing alpha-interferon|
    KR100369582B1|1995-09-04|2003-04-03|동아제약 주식회사|Purification method of recombinant alpha-interferon|
    DK1129111T3|1998-11-12|2009-01-05|Schering Corp|Process for converting interferon isoforms and products thereof|
    ITBO20010426A1|2001-07-06|2003-01-07|Alfa Wassermann Spa|PHARMACOLOGICALLY ACTIVE PROTEIN PURIFICATION PROCESS BY CATIONIC EXCHANGE CHROMATOGRAPHY|
    EP2292637B1|2002-09-06|2016-01-06|Genentech, Inc.|Process for protein extraction|
    GB0818228D0|2008-10-06|2008-11-12|Avecia Biolog Ltd|Purification process|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DE3515336A|DE3515336C2|1985-04-27|1985-04-27|Process for the preparation and purification of â-interferon|
    [返回顶部]